抗體表位繪圖

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 朱貴東

簡(jiǎn)要過(guò)程：

抗原編碼基因的PCR擴(kuò)增和超聲分散。端點(diǎn)通過(guò)接合作用被克隆和修復(fù)，然后重組到大腸桿菌中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株庫(kù)，并且用QPix2XT (Genetix)挑選菌落。培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)菌在22.2 × 22.2cm的硝酸纖維素薄膜上形成菌斑。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的點(diǎn)印跡，用于在Typhoon?掃描器下進(jìn)行熒光檢測(cè)。細(xì)胞有一個(gè)積極地（這里的一個(gè)亮點(diǎn)）用于質(zhì)粒制備和測(cè)序的點(diǎn)。衍生的序列有一致的抗原決定簇。最小重疊序列分別克隆并且受到抗原決定簇驗(yàn)證。

人高多樣性VDR肽庫(kù)的產(chǎn)生:
對(duì)于庫(kù)的構(gòu)建，就像材料和方法上所描述的那樣，PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)VDR的開(kāi)放閱讀框，超聲波分散，并克隆到表達(dá)載體用于大腸桿菌中重組蛋白的生產(chǎn)。大約有1 × 106個(gè)獨(dú)立克隆產(chǎn)生，足以成為一個(gè)單一的割裂基因庫(kù)（見(jiàn)下文）。創(chuàng)建庫(kù)的復(fù)雜性估計(jì)要連續(xù)30個(gè)隨機(jī)選擇的克隆。在長(zhǎng)度為17至30個(gè)氨基酸的大概會(huì)插入30%， 30個(gè)氨基酸的約50%，30至50個(gè)氨基酸的約20%，所有合適的大小均用于抗原表位繪圖。測(cè)序分析儀也表明克隆效率為90％。根據(jù)理論假設(shè)，1/6的克隆可以插入正確的框和方向并且有90％的克隆效率，那么至少有150，000個(gè)正確插入的克隆框應(yīng)該存在VDR的片段庫(kù)。如此多的開(kāi)放閱讀框應(yīng)完全覆蓋重疊插入了人VDR基因。

庫(kù)的構(gòu)建:
人VDR基因編碼在結(jié)合營(yíng)養(yǎng)衍生配體中起重要作用，它是一個(gè)核受體家族成員的轉(zhuǎn)錄因子，能施加影響促進(jìn)骨礦物質(zhì)平衡。PBD-GATE2載體克隆人全長(zhǎng)VDR核酸序列，通過(guò)基因特異引物擴(kuò)增（正向：5′-ATGGAGGCAATGGCGGCCAGCA-3′; 反向：5′- AGGAGATCTCATTGCCAAACA-3′）。用Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System（(Promega, Madison, WI)）根據(jù)試劑盒的說(shuō)明純化1.2Kb的PCR產(chǎn)物，然后超聲分散。超聲波處理的DNA瓊脂糖凝膠電泳分離顯示片段下降到100bp。將100-300bp的片段再純化并用End-It? DNA End-Repair Kit（Epicentre, Madison, WI）處理平末端。為了獲得操作的靈活性，我們將片段克隆到設(shè)計(jì)用于特異位點(diǎn)重組克隆的載體(in-house-created Entry vector)。為了達(dá)到這一目的，載體pDONR?/ ZEO(Invitrogen, Carlsbad, CA)配備了一個(gè)平末端克隆的酶切位點(diǎn)。接合pDONR?/Zeo and attL × attR-directed后，重組到細(xì)菌表達(dá)載體pDEST?15 (Invitrogen)，獲得個(gè)1 × 106單克隆。

蛋白質(zhì)陣列，菌落斑和重組蛋白表達(dá)的建立：
庫(kù)中的pDEST?15用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star?(DE3)中的感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞接種到含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中。共有2304個(gè)菌落被QPix2XT robot (Genetix, New Milton, Hampshire, UK)挑選到384微孔板含補(bǔ)充氨芐青霉素(100 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)菌在0.45μm孔徑的PROTRAN?硝酸纖維轉(zhuǎn)化膜(Whatman GmbH, Dassel, Germany)上形成菌斑。細(xì)胞生長(zhǎng)在37 °C，在這種覆蓋固體LB培養(yǎng)基的膜上過(guò)夜。通過(guò)轉(zhuǎn)膜到輔以氨芐青霉素和異丙基-β-D-1-半乳糖苷(IPTG; 0.5 mM)的固體LB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)蛋白表達(dá)且在37℃下孵育三小時(shí)。

抗原表位的篩選和檢測(cè)：
將這些膜上的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有0.02％Tween-20與3％的的印跡高檔奶粉(Carl-Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)的PBS中進(jìn)行細(xì)胞溶解，這些釋放的重組蛋白約束在硝化纖維上。為了檢測(cè)，所用的是改善的點(diǎn)印記工藝，這是擴(kuò)大到容納22.2×22.2平方厘米大的膜，且熒光標(biāo)記二抗并在Amersham Typhoon? Scanner (Amersham, Pittsburgh, PA)上進(jìn)行熒光掃描。起初用的抗體是市售鼠標(biāo)單克隆IgG2A的抗人類(lèi)VDR抗體(sc-13133; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。為了便于，用到的是Alexa Fluor? 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Invitrogen)。用Amersham Typhoon?掃描儀檢測(cè)代表陽(yáng)性抗體結(jié)合的點(diǎn)陣列。在532nm處激發(fā)，用526nm的濾光器測(cè)量輻射。只有那些在背景下發(fā)出至少100％的熒光信號(hào)的點(diǎn)才被視為命中和易于DNA測(cè)序。我們通過(guò)計(jì)算平均10個(gè)隨機(jī)選取的非熒光點(diǎn)來(lái)定義背景。

DNA測(cè)序和分析：
細(xì)菌培養(yǎng)的在蛋白陣列上代表陽(yáng)性點(diǎn)的細(xì)胞易于發(fā)生質(zhì)粒脫離。載體特異引物(5′-GGCAAGCCACGTTTGGTG-3′)在ABI 3130 Genetic Analyzer Capillary Array (Applied Biosystems, Foster City, CA)上標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧測(cè)序。檢查并校正產(chǎn)生的序列。最小重復(fù)序列用于進(jìn)一步的驗(yàn)證。

Western雜交和免疫熒光：
DNA序列編碼由Gateway?兼容的通過(guò)第一個(gè)特異的，然后輔以適配引物再克隆到pDONR?/Zeo (Invitrogen)里制造的37個(gè)氨基酸抗原決定簇。經(jīng)過(guò)attL×ATTR重組，最小的序列穿梭到pDEST?15（Invitrogen）。首先，用pDEST?15抗原決定簇構(gòu)象轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star? (DE3) cells (Invitrogen),并用0.5 mM IPTG在指數(shù)增長(zhǎng)階段處理2小時(shí)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。用MagneGST?蛋白純化系統(tǒng)(Promega)根據(jù)配套協(xié)議純化重組蛋白。Western雜交操作步驟，純化后的蛋白和天然裂解液用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。使用相同的抗VDR抗體。酸性磷酸酶連接的羊IgA抗鼠抗體(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)被用作輔助檢測(cè)抗體。在內(nèi)部創(chuàng)建的一個(gè)有終止密碼子的pDEST?15載體被用來(lái)作為裂解的陰性對(duì)照，來(lái)自細(xì)胞全長(zhǎng)VDR pDEST?15表達(dá)的細(xì)胞裂解被用作陽(yáng)性對(duì)照。作為一個(gè)驗(yàn)證步驟，純化的抗原表位致使抗VDR單克隆抗體抗原表位結(jié)合位點(diǎn)飽和，作為一個(gè)對(duì)照組，等量的非敲除抗VDR單克隆抗體被用到。在ph7.4時(shí)用PBS洗滌密集的6微米人皮膚組織冰凍切片，用4％的甲醛在PBS中固定10min，用0.25% Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Germany)在PBS中滲透5min，最后用3倍的PBS洗滌5min。用敲除和非敲除的抗VDR單克隆抗體分別在4℃下做過(guò)夜處理，對(duì)皮膚切片進(jìn)行探索。陸續(xù)在PBS洗滌5min后，Alexa Fluor? 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG (Invitrogen)被用來(lái)作為在4℃下1小時(shí)潛伏期的輔助檢測(cè)抗體。在PBS洗5min后，這些切片用4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI; dilution 1:2000 in PBS; Sigma-Aldrich)作最終處理并且用Zeiss Axioskop MC100 (Carl-Zeiss Micro Imaging, G?ttingen, Germany)檢測(cè)。